1 傳統檢測方法的原理和缺點1.1 傳統檢測方法的原理
目前，啤酒腐敗菌的檢測，特別是啤酒生產企業，大多數在人工制作培養基上培養。其原理是根據不同腐敗菌生長所需的營養成分、最適溫度、最適pH，在其適宜的溫度下培養，然后根據不同菌落、細胞特征及一些生理生化特征的鑒定來確定腐敗菌的類型。理論上只要在啤酒中有一個腐敗菌的細胞，就能在適宜的溫度、培養基上大量生長繁殖。然后通過菌落形態、細胞形態、革蘭氏染色、過氧化氫酶陽性以及一系列生理生化實驗來鑒定這些腐敗菌。
1.2 傳統檢測方法的缺點
盡管目前許多企業仍然在用傳統方法檢測啤酒中的腐敗菌，但傳統檢測方法有以下幾方面的不足。
1.2.1 檢測所需的時間長：一般的腐敗菌檢測至少需要2~5d，甚至7d以上。檢驗結果出來時往往產品已經進入市場，具有嚴重的滯后性。
1.2.2 操作繁瑣，自動化程度不高：傳統的檢測方法往往需要花費大量的人力。適合不同腐敗菌生長的培養基以及不同腐敗菌適宜生長的pH、溫度等都需要花費一定的人力和時間，觀察菌落特征、細胞特征、革蘭氏染色以及生理生化鑒定等步驟較繁瑣。而且，研究表明，沒有一種培養基適合所有的啤酒腐敗菌生長。
1.2.3 檢測結果不夠準確：啤酒腐敗菌包括一些乳酸菌、醋酸菌和野生酵母等，特別是一部分乳酸菌具有酒花抗性，它們是最重要的啤酒腐敗菌。幾乎所有的乳酸菌都能在啤酒中生長，但只有一部分乳酸菌才能使啤酒腐敗變質。所以，用傳統的檢測方法不能真正準確地檢測出啤酒的腐敗菌。
2 PCR技術檢測啤酒腐敗菌的原理和特點
PCR技術是由Kleppe等人在1971年首先提出的。它是通過對人工耗時長或難以培養的微生物的DNA或RNA片斷的擴增來對啤酒中腐敗菌進行檢測的。首先通過高溫變性、低溫退火、適溫延伸完成對目的基因的擴增階段，然后將PCR產物通過瓊脂凝膠電泳分析。整個過程可在1h內完成。而且從理論上講，只要啤酒中含有一分子的腐敗菌的DNA或RNA片段，即可在短時間內通過PCR技術大量擴增并檢測到。所以，PCR檢測技術在啤酒腐敗菌的檢測中顯示出其他方法無法比擬的優點———快速、便捷、準確。
根據PCR擴增使用的引物不同。用PCR技術檢測啤酒中腐敗菌的方法大體可歸為3種類型：使用特異性引物的PCR檢測方法；使用任意引物的PCR檢測方法；使用嵌套式引物的PCR檢測方法。
3 用特異性引物的PCR檢測方法
3.1 根據抗酒花基因horA設計特異性引物
盡管啤酒中的許多成分對微生物造成很大的抑制作用，但一些微生物（主要是一些乳酸菌）卻仍然能在啤酒中生長繁殖，并使啤酒產生渾濁、沉淀、異味和雙乙酰等腐敗現象。有趣的是，這些對革蘭氏陽性菌有抑制作用的酒花物質（主要是異-α-酸）對這些乳酸菌卻無濟于事。因此，許多學者都致力于抗酒花機理和基因的研究。日本學者從抗酒花菌株短乳桿菌ABBC45的質粒上鑒定得到抗酒花基因horA，后經研究發現，能引起啤酒腐敗的乳桿菌均含有似horA的基因。1997年，Manabu Sami等還發現啤酒腐敗菌中這些含有抗酒花基因的質粒拷貝數與酒花抗性大小的增減性是一致的，這說明horA基因與酒花抗性有關。東京大學、加利福尼亞大學的研究者通過設計特異性引物對一系列乳桿菌的horA基因擴增進行檢測，已成功地從啤酒中對乳桿菌、干酪乳桿菌、胚芽乳桿菌進行了檢測，且準確性高，整個horA-PCR檢測過程大約需6h，比傳統的平板培養方法要快得多。
3.2 根據其他一些與酒花抗性有關的基因設計引物
K.suzuki等對啤酒腐敗菌的研究發現，在對完全喪失腐敗能力的短乳桿菌ABBC45CC（是經過短乳桿菌ABBC45C次級培養獲得的）分析發現，質粒PRH45Ⅱ在短乳桿菌ABBC45CC中丟失，隨后通過對質粒PRH45Ⅱ上的不同區域的片段進行切除，結果發現啤酒腐敗菌缺少ORF5的比例相當高，所以通過對OFRF5的序列設計引物來進行PCR技術檢測啤酒腐敗菌也取得了一定效果。最近，Koji Suzuki和T.Fujii通過大量的實驗研究表明，一些含有horA基因的乳桿菌也并不具有腐敗能力，而且他們發現丟失horA基因的L.brevisABBC45-L.brevisAB-BC45C仍然有一定的腐敗能力。因此，他們認為抗酒花機制是由多重基因控制決定的。Koji Suzuki對51株啤酒腐敗菌研究，還發現有兩個基因horB和horC與酒花抗性有關。研究發現，通過對horB/horC基因的擴增能檢出其中的49株腐敗菌，且無假陽性的檢出。因此，他們認為PCR技術檢測通過結合horA、horB/horC基因能大大提高啤酒中腐敗菌的檢測，同時可避免由horA引起的假陽性現象。
3.3 根據分類鑒定法設計特異性引物
啤酒中腐敗菌主要是乳酸菌，其中主要包括短乳桿菌、有害片球菌、林氏乳桿菌等，短乳桿菌、有害片球菌是啤酒中很有名的腐敗菌，而林氏乳桿菌到目前為止發現的所有菌株都是啤酒腐敗菌。因此，有人用分類鑒定的核糖體RNA上的基因序列來檢測啤酒中的這些腐敗菌。加拿大Labatt公司的研究人員在啤酒腐敗菌的乳酸菌的檢測中使用5S和16SRNA基因進行PCR擴增，用于菌種的特性鑒定。目前已成功地對乳桿菌、片球菌、明膜串珠菌屬中的菌株作出鑒定。日本為了提高PCR分析的靈敏度和特異性，根據16SrRNA和23SrRNA之間的間隔區的特異性序列來設計引物，用于啤酒腐敗菌的PCR檢測。這種方法比較快捷、方便，但有時難以將種內一些腐敗菌和非腐敗菌區分開。
3.4 利用任意引物的PCR檢測方法（RAPD-PCR）RAPD-PCR是使用較短的寡核苷酸引物擴增一群長度不等的DNA片段混合物，這些產物經瓊脂糖凝膠電泳呈現出的帶型，反映了用于擴增模板的DNA分子的總體結構特征，所以能夠測出2個生物體（包括同一物種的不同個體）基因之間的差異。親緣關系越近的種，PCR擴增帶型就越相似，反之差異懸殊。
使用RAPD-PCR技術，所需DNA提取物少，在10h內能檢測出啤酒污染的結果，每一種引物能產生惟一的特異性指紋圖譜，將其對照便得到鑒定結果，加拿大LABATT公司的研究人員運用此技術鑒別啤酒腐敗細菌的種和亞種。
3.5 利用嵌套式引物的PCR檢測方法（Nest-PCR）Nest-PCR是利用第一輪PCR產物作為第二輪PCR擴增的起始原料，除使用第一輪的一對特異性引物外，還加一對結合位點處在前2個引物之間的新引物。
啤酒中含有大量的酵母，因此用PCR技術檢測啤酒中腐敗菌時，酵母會對其形成一定的干擾。使用普通的PCR檢測腐敗菌時，酵母細胞的存在如果大于3×104（上角）時，就會干擾細菌的鑒定。如果對樣品進行稀釋來降低酵母的干擾，同樣也會降低檢測水平。而使用Nest-PCR檢測腐敗菌時，由于第一輪反應之后增
文章來源華夏酒報加了靶模板數量，使第二輪反應的效率明顯提高；由于第一輪反應產物比第一輪反應的模板DNA小，所以在第二輪反應過程DNA變性時間縮短，也使得反應速度加快。
加拿大Labatt公司的研究者通過實驗確定和檢測用于乳酸菌鑒定的Nest-PCR的引物，實驗結果表明，當酵母和細菌細胞之比為1.6×104（上角）∶1時，凝膠電泳清晰可見。Nest-PCR技術使在發酵結束和酵母回收前24h內完成對污染菌的檢測分析成為可能，從而確保了啤酒生產中微生物的控制。
因此，Nest-PCR技術檢測啤酒腐敗菌能提高檢測效率，特別是對含有高濃度酵母細胞的樣品的檢測。
4 PCR技術檢測啤酒腐敗菌的發展趨向
隨著分子生物學、光學、免疫學、微生物學、計算機技術的快速發展，應用PCR技術檢測啤酒腐敗菌也越來越趨向于同其他技術緊密結合應用。
4.1 取樣
在取樣階段，研究者發現，啤酒中高濃度物質的存在對PCR的靈敏度也有一定的影響。當利用膜過濾啤酒富集乳酸菌用于檢測時，實際靈敏度也隨過濾啤酒體積增加而降低。而不同啤酒的抑制因子也有所不同。日本學者通過在特異性引物的PCR實驗（L.lindner）中發現使用水樣檢出限（63cfu）比啤酒的檢出限（9cfu）明顯低，這說明啤酒中存在一些抑制因子。
Di Michele和Le Wis進行了大量的實驗發現，用纖維素酯膜過濾，在丙酮酸中溶解，積累于膜上的PCR抑制因子并沒有除去；采用聚碳酸酯膜，用十六烷基三甲基溴化銨溶液提取，僅適用一些含菌量高的樣品；用聚碳酸酯膜過濾，將膜溶于四氯化碳-異戊醇，再轉入Eppendorf管中加水、離心沉淀、取上清液、再加水離心沉淀處理后靈敏度大大提高。日本的學者也用了類似的方法提高了檢測限度。
4.2 引物使用
在使用引物方面，目前盡管研究者已經發現從L.brevisABBC45的大小為15.1kb的質粒pRH45上分離得到的horA基因與細菌的抗酒花作用有很大的關系。但也有一些實驗表明，丟失含有horA基因的質粒pRH45的L.brevisABBC45C 仍然有一定的抗酒花性，這說明抗酒花還可能存在其他基因控制。特別是在對抗酒花菌株質粒ORF上的一些核苷酸序列的研究表明（ORF5研究比較深入），其也與抗酒性有很大關系。因此，PCR技術檢測啤酒中腐敗菌的設計引物要從單一的特異性引物向多種特異性引物發展。不久的將來啤酒腐敗菌的定量檢測也會實現。
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編輯：張怡
