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用微生物生產多糧濃香型白酒風味物質的研究尹昌樹1，劉波1，張義正3，陳大理1，岳明生
    　以五糧液為代表的宜賓多糧濃香型白酒的生產離不開當地獨特的自然環境。作為中國酒都，地處三江交匯處，宜賓特殊的氣候環境孕育出了獨特的釀酒微生物生態區系。一般認為，在濃香型白酒生產過程中，霉菌主要起糖化作用，酵母發酵產生酒精，細菌主要參與形成白酒復雜的風味和香氣。四川省申聯生物科技有限責任公司的科技人員利用純培養的方法對多糧濃香型白酒生產環節中優勢細菌開展研究，篩選出5株對宜賓多糧濃香型白酒酒體獨特風格起主要作用的微生物菌株，并運用現代發酵技術及超臨界萃取技術生產出多糧濃香型白酒風味物質。

    　1材料與方法
    　1.1材料
    　1.1.1菌種

    　從四川某濃香型酒廠釀酒車間的窖泥、酒糟、曲藥、黃水中篩選。分別編號SL0015、SL0061、SL0098、SL0106、SL0158，4℃保藏備用。

    　1.1.2試劑
    　高純二氧化碳，食品級99.99%。
    　1.1.3主要儀器和設備

    　Agilent CC 6890－5975rnfKs，美國安捷倫科技有限公司；AgilentC－C6890－FID，美國安捷倫科技有限公司；DD－6低速大容量離心機，濟南福的機械有限公司；超臨界萃取設備，HA120－50－01A，江蘇南通華安超臨界萃取有限公司；UF－20型實驗型超濾裝置，華泰凈化技術工程有限公司；10L發酵罐，50L發酵罐，江蘇鎮江東方生物工程設備技術有限責任公司。

    　1.1.4培養基
    　1.1.4.1種子液培養基
    　牛肉膏蛋白胨培養基、葡萄糖胰胨培養基。
    　1.1.4.2發酵培養基（g/L）

    　1.2 方法
    　1.2.1種子液培養
    　將菌種接種于種子培養液中，其中SL0015、SL0098、SL0106培養溫度42℃，150rpm，培養28小時。SL0061、SL0158培養溫度35℃，靜止培養，培養3天。

    　1.2.2發酵培養
    　1.2.2.1各菌種單獨培養。
    　1.2.2.2各菌種混合培養。
    　1.2.3感官評定

    　品評人員由國家評酒委員和從事白酒研究工作并經過半年聞香訓練的人員組成。每個樣品由4名品評人員分3次進行品評。在20℃的品評環境下，評價發酵液的濃香，按很弱、弱、一般、強、很強5個等級分類。

    　1.2.4發酵液中特征性風味化合物的分析

    　1.2.4.1GC—MS分析
    　樣品通過DB—Wax毛細管柱進行分離，程序升溫條件：初溫40℃，恒溫5min，然后以8℃/min的速率升至230℃，保持30min。進樣量：1μL，不分流。載氣：He；流速：2 mL/min。分離后的樣品用Agilent5975MSD鑒定。質譜條件El：電離源；電子能量：70eV；離子源溫度：230℃；掃描范圍：30amu—550amu。

    　1.2.4.2 物質定性分析
    　將未知物質譜圖與NIST 08a.L Database（Agilent Technologies Inc．）中標準譜圖進行比對定性。

    　1.2.5超臨界CO₂ 萃取

    　1.2.5.1預處理
    　發酵液→粗過濾→超濾→清液

    　1.2.5.2　
    　取1L發酵清液投入萃取釜，將萃取釜溫度升至設定值后開啟CO₂ 泵，萃取壓力升至設定值后進行流動萃取，從解析釜出料口得萃取物，將所得液體進行GC－MS分析。

    　2結果與討論

    　2.1單獨培養與混合培養比較

    　發酵結束后，取樣進行感官評價。通過菌種單獨培養與混合培養所產香氣的比較可以看出，篩選出的菌株進行單獨培養，所產香氣均不強，而混合培養，則香氣濃。這與菌種間的協同作用有關，因為某種菌種的產物可能是另一種菌種的前體物質，或是兩種菌種的產物在酶的作用下進行一些反應，如酯化反應等。

    　2.2混合培養條件的研究

    　2.2.1培養基的選擇

    　利用上述培養基分別發酵，發酵結束后，取樣進行感官評價，通過不同培養基生長情況及產香情況的比較可知，培養基A營養豐富，菌種生長快，但產香弱；培養基C產香強，但生長太慢；而培養基B取了A、C的優點，菌種生長較快，產香強。選培養基B作為以下試驗的培養基。

    　2.2.2培養溫度的選擇
    　我們以下列控溫方式做試驗：①35℃，②先35℃后42℃，③42℃，發酵結束后，取樣進行感官評價。

    　通過不同控溫方式對產香的影響比較可知，控溫方式以先35℃后42℃為最佳。

    　2.3超臨界CO₂ 萃取條件的研究

    　2.3.1萃取溫度的確定

    　超臨界CO₂ 的臨界點為7.52MPa、31.1℃，因此試驗的溫度、壓力都不能低于這個數值。另外， 由于超臨界CO₂所萃取的物質一般都為熱敏性物質，萃取溫度不能太高，所以對萃取溫度的調節非常重要。通過四組單因素試驗確定萃取溫度，試驗結果見表1。

表1  萃取溫度選取試驗

    　通過以上試驗可以看出，3號樣雖然萃取率略低于2號樣，但其風味更佳，所以萃取溫度選為45℃。

    　2.3.2 萃取壓力的確定
    　選取萃取壓力的試驗結果見表2。

表2  萃取壓力選取試驗

    　從表2可以看出，13號樣品萃取率高且風味好，因此萃取壓力確定為15MPa。

    　2.3.3 CO₂流量的確定

    　選取CO₂流量的試驗結果見表3。

表3   CO₂流量的選取試驗

    　從表3可以看出，不同的CO₂流量對所得萃取物的品質無影響，但在相同的萃取時間下，流速越大，取得率越高。因此，確認CO₂流量為10L/h。

    　2.3.4&n文章來源華夏酒報bsp;分離溫度的確定

    　選取分離溫度的試驗結果見表4。

表4   分離溫度的選取試驗

    　從表4可以看出，分離溫度越低，萃取率越高，但品質不好，分離溫度選取為50℃。

    　2.3.5分離壓力的確定

    　選取分離壓力的試驗結果見表5。

表5   分離壓力的選取試驗

    　從表5可以看出，分離壓力越大，萃取率越低，但品質更好，綜合考慮確定分離壓力為7MPa。

    　2.3.6 解析釜壓力、溫度的確定

    　為確保在解析釜中萃取物質的完全解析，解析壓力越低越好，但考慮到CO2能重復利用， 因此， 解析壓力與CO2儲罐中壓力相同, 即在4.5—6.0MPa之間，解析釜溫度設定為55℃。

    　2.3.7 萃取時間的確定

    　萃取時間在4h 后， 產品得率很小， 因此將萃取時間定為4h。

    　3結論

    　3.1以篩選的微生物菌株進行多糧濃香型白酒的呈香呈味物質的生產，并確定了多菌種混合發酵的培養模式。

    　3.2確定了發酵液進行超臨界CO₂ 萃取的最佳工藝：萃取壓力15 MPa,萃取溫度45℃，CO流量為10L/h，柱分離壓力為7MPa, 分離溫度為50℃，解析釜分離壓力為4.5—6.0 MPa, 溫度為55℃，萃取時間為4h。

    　3.3所得萃取液經專家鑒定，具有典型的多糧濃香型白酒的風味：白酒固態發酵感強，糧香突出，糟香優雅，窖香柔和。