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　　一、前言

　　果酒釀造是一個復雜的生物工程，釀造微生物種類繁多。不同酒種生長的微生物也不盡相同，不同的原料自身會帶有不同的菌群，這些菌群自始至終參與酒的發酵，不同的菌群發酵代謝的產物也各不相同，這些產物給發酵的質量、風格帶來了重大影響。

　　桑椹為多年生木本植物，其成熟果子果肉多汁、皮薄嬌嫩。而由于桑棋富含多種營養物質，加之采摘期間高溫潮濕，成熟果易腐爛、霉變，從而造成發酵的污染及陳釀酒的感染等，因此會改變桑椹酒風味，并破壞發酵酒的生物穩定性，損害發酵酒的品質。因此，研究與鑒定污染桑椹果酒的微生物種，查找發酵酒的污染源，了解污染微生物的代謝規律，找出有效控制果酒被污染的方法，對提高桑椹酒的品質及企業經濟效益具有十分重要的意義。

　　二、桑椹發酵酒污染菌的分離鑒定方法

　　1.材料與方法

　　1.1 主要儀器設備

　　T－200型電子天平，752紫外光柵分光光度計，電熱恒溫培養箱，電熱鼓風干燥箱，可控硅控溫水浴鍋，電子調溫萬用電爐，光學雙筒顯微鏡，高速組織搗碎機，微生物凈化室，手提式滅菌鍋，JYT－架盤藥物天平，旋渦混合器，酒精計，精密pH計，家用冰箱。

　　1.2 樣品的采集

　　寧波天宮莊園果汁果酒有限公司被污染的發酵酒，分別從33＃、42＃、88＃、107＃罐取出。

　　1.3 培養基

　　1.3.1 細菌培養基

　　（1）MRS培養基：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母浸膏5g，葡萄糖10g，吐溫－80 1g，磷酸氫二鉀2g，乙酸鈉5g，檸檬酸三銨2g，MnSO4.H2O 0.2g，MgSO4·7H2O 0.04g，瓊脂20g，pH6.3，蒸餾水1000mL。

　　（2）營養瓊脂培養基（NA）：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，瓊脂20g，pH 7.2—7.4，蒸餾水1000mL。

　　（3）WLN培養基：葡萄糖50g，酵母提取物4g，蛋白胨5g，FeCl3·6H2O 0.0025g，KCl 0.425g，MgSO4·7H2O 0.125g，MnSO4 0.0025g，CaCl2·2H2O 0.125g，瓊脂20g，pH5.5—5.8，蒸餾水1000mL。

　　1.3.2 真菌用培養基

　　（1）土豆培養基（PDA）：200g土豆切碎后，加800mL水，100℃煮沸1h后，用一層紗布過濾，然后加入20g葡萄糖，最后用蒸餾水定容到1000mL。

　　（2）察氏培養基（CPK）：NaNO3 3g，K2HPO4 1g，KCl 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，蔗糖30g，蒸餾水1000mL。

　　1.4 平板分離培養方法

　　（1）稀釋分離：取數支無菌空試管排列于試管架上，根據待稀釋的濃度分別依次標明10-1、10-2、10-3、10-4、10-5，并向試管中各加入9mL無菌生理鹽水。

　　用1mL無菌吸管精確吸取1mL已充分混勻的文章來源華夏酒報待測酒樣，注入10-1試管中。然后，另取1支無菌吸管，于10-1試管中來回吹吸三次，使之混勻，即成10-1稀釋液。再從10-1試管中吸1mL注入10-2試管中，重復上述操作，直至制成10-２、10-3、10-4、10-5稀釋液。

　　（2）傾注平板：取無菌培養皿若干套，每3套為一組，在每組皿底分別寫上稀釋度，再用對應的1mL無菌吸管分別吸取10-1、10-2、10-3、10-4、10-5稀釋液各1mL，對應放入編好號的無菌培養皿中，盡快向上述盛有不同稀釋度菌液的平皿中倒入融化后冷卻至45℃—50℃左右的培養基，每皿約15mL，置水平位置迅速旋轉平皿，使培養基與菌液混合均勻，而又不使培養基蕩出或濺到皿蓋上，待培養基凝固。

　　（3）涂布平板：用對應的1mL無菌吸管分別吸取10-1、10-2、10-3、10-4、10-5稀釋液各0.1mL，對應放入已編好號的預先制備好的空白平板中，迅速用無菌玻璃涂布棒（將玻璃涂布棒沾取酒精，在酒精燈火焰上灼燒，在培養皿上蓋上冷卻后使用）將稀釋菌液均勻地涂抹在整個培養基的表面，至稀釋液完全被吸收。

　　（4）培養：倒置于恒溫培養箱中培養（細菌用37℃，真菌用30℃），觀察菌落形態和分散狀況，挑取單菌落轉接斜面。

　　（5）計數：數各皿中的菌落數，算出同一稀釋度3個平皿上菌落的平均數，按照計數報告原則計算結果。