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摘　要：以優(yōu)質(zhì)五糧發(fā)酵池的窖泥為基材，對(duì)其進(jìn)行熱選條件的優(yōu)化，分離純化后得到的己酸菌制成己酸菌液。觀察其產(chǎn)氣能力、生長(zhǎng)周期、活菌數(shù)量，用以得到最優(yōu)化的熱處理?xiàng)l件。

實(shí)驗(yàn)中五糧發(fā)酵池的窖泥菌液，在90℃恒溫處理5min，冷卻后接入己酸菌培養(yǎng)液中培養(yǎng)，得到的己酸菌更優(yōu)質(zhì)。

關(guān)鍵詞：窖泥，己酸菌，熱處理，分離純化

汪慧慧　杜祥寶　李慶騰　秦方園　李順濤　習(xí)小紅　高碩　孫小雨

(山東百脈泉酒業(yè)股份有限公司)

1 引言

在中國(guó)白酒中，濃香型白酒有舉足輕重的地位，其酒質(zhì)和產(chǎn)量，又離不開生產(chǎn)中菌種質(zhì)量及數(shù)量的多少。己酸菌是濃香型白酒釀造中產(chǎn)己酸乙酯主體香成分的功能菌。它屬于厭氧棱狀芽孢桿菌，其孢子具有耐熱性。近年來，百脈泉酒業(yè)技術(shù)中心將優(yōu)質(zhì)五糧老窖窖泥為基材，對(duì)窖泥進(jìn)行熱處理?xiàng)l件的優(yōu)化，以得到更加優(yōu)良的己酸菌菌種。該菌種產(chǎn)氣旺盛、菌種健壯，廣泛應(yīng)用于濃香型大曲酒的窖池保養(yǎng)、人工窖泥培養(yǎng)等。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

樣品：雙輪底發(fā)酵池的窖泥，五糧發(fā)酵池的窖泥，三糧發(fā)酵池的窖泥。

培養(yǎng)基：無水乙酸鈉5g/L(AR)，酵母膏5g/L(AR)，硫酸銨4g/L(AR)，磷酸氫二鉀0.2g/L(AR)，硫酸鎂0.2g/L(AR)，碳酸鈣5g/L(CP)，硫酸銅指示劑。

器材：立式壓力蒸汽滅菌鍋，生化培養(yǎng)箱，N-120(A)型生物顯微鏡，無菌操作臺(tái)，實(shí)驗(yàn)室超純水器，抽氣針筒，移液管。

2.2實(shí)驗(yàn)過程

1.用無菌水配置3000ml的己酸菌培養(yǎng)基，封口后，121℃滅菌30分鐘。同時(shí)滅菌待用的250ml三角瓶，移液管。待培養(yǎng)基降溫至32℃～34℃時(shí)，放入無菌操作臺(tái)或無菌接種室紫外線滅菌20分鐘，分裝至250ml三角瓶備用。

2.取自然發(fā)酵池的老窖泥10g，用無菌水定容至100ml，充分混勻。熱處理?xiàng)l件進(jìn)行處理。

3.將熱處理后的窖泥加入250ml三角瓶中，接種量為10%，充分混勻。最后每瓶各加乙醇含量為2%～3%，封口后放置33℃的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察。

3結(jié)果與討論

3.1窖泥的選擇

取百脈泉酒業(yè)的雙輪底發(fā)酵池的窖泥，五糧發(fā)酵池的窖泥，三糧發(fā)酵池的窖泥各10g，加無菌水定容至100ml ，搖勻。取原菌液1ml，加9ml的無菌水混勻，依次稀釋，得稀釋度10-1、10-2、10-3、10-4。用血球計(jì)數(shù)板顯微鏡計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)時(shí)注意稀釋度是否合適，不能太濃或太稀，計(jì)數(shù)得每克窖泥所含的總菌數(shù)。

實(shí)驗(yàn)測(cè)得1g雙輪底發(fā)酵池的窖泥總菌數(shù)為3.8×1010個(gè)，1g五糧發(fā)酵池的窖泥5.1×1010個(gè)，1g三糧發(fā)酵池的窖泥2.6×1010個(gè)，其中五糧發(fā)酵池的窖泥總菌數(shù)含量最高，基于窖泥中微生物的種類和數(shù)量均定著窖泥的質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)選取五糧發(fā)酵池的窖泥為基材，開展己酸菌的熱處理?xiàng)l件優(yōu)化的研究。

3.2窖泥培養(yǎng)液的熱處理?xiàng)l件優(yōu)化

3.2.1熱處理溫度的選擇

取五糧發(fā)酵池窖泥，制備菌液，經(jīng)熱處理后接種到液體培養(yǎng)基中，放置33℃的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察。

由表1可以看出，當(dāng)水浴時(shí)間均處理10分鐘時(shí)，由于不同己酸菌孢子及其他菌類的耐熱程度有一定的差異，隨著溫度的升高，總菌數(shù)呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，但隨著溫度的上升，生長(zhǎng)周期延長(zhǎng)，菌種被鈍化。

根據(jù)生物顯微鏡觀察，不難發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的升高，雜菌數(shù)量減少，90℃處理培養(yǎng)后未見雜菌。如表1。

3.2.2熱處理時(shí)間的選擇

由于菌液經(jīng)條件為90℃10min處理后活菌數(shù)雖然減少，但根據(jù)生物顯微鏡觀察無雜菌，處理后發(fā)酵最能達(dá)到分離純化的目的。即本公司選定90℃為熱處理溫度，水浴時(shí)間分別設(shè)置為3min，5min，7min，10min，經(jīng)熱處理后接種到液體培養(yǎng)基中，放置33℃的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察。

實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)溫度為90℃時(shí)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，總菌數(shù)減少，且生長(zhǎng)周期增長(zhǎng)。熱處理5min與3min相比而言，總菌數(shù)量差別不大，但熱處理3min后的培養(yǎng)液，鏡檢觀察有少量雜菌，故本公司選定熱處理優(yōu)化條件為90℃5min。如表2。

3.3己酸菌菌液的性能測(cè)試

3.3.1己酸菌產(chǎn)氣觀察

經(jīng)熱處理后的培養(yǎng)液，生長(zhǎng)周期為5天，實(shí)驗(yàn)中的生長(zhǎng)周期為液體培養(yǎng)基中見明顯氣泡產(chǎn)生。延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，以熱處理后的液體培養(yǎng)基為母液，接種到第三代時(shí)生長(zhǎng)周期縮短為4d，產(chǎn)氣旺盛，說明熱處理使己酸菌純化，且因受到鍛煉而增強(qiáng)了活力。

3.3.2已酸菌鏡檢及產(chǎn)酸鑒定

延長(zhǎng)發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間到13d，先把待測(cè)菌液稀釋到合適濃度，用生物顯微鏡觀察只見桿菌和芽孢未見其他雜菌且生長(zhǎng)活躍，直接計(jì)數(shù)可達(dá)6.3億個(gè)/m l。

取待測(cè)菌液3ml放入比色管內(nèi)，再加入2%硫酸銅溶液1ml最后加入乙醚2m l，蓋好搖勻，靜置3分鐘，管內(nèi)分層，上層可見綠色且顏色較深，說明己酸菌生長(zhǎng)良好且有己酸產(chǎn)生。

4結(jié)論

擴(kuò)大培養(yǎng)時(shí)己酸菌菌種的選取至關(guān)重要，本公司對(duì)窖泥的熱處理優(yōu)化條件進(jìn)行了嚴(yán)格檢測(cè)，熱處理溫度、時(shí)間這兩個(gè)因素相互影響，在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，結(jié)合本公司對(duì)己酸菌培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)的純度要求，優(yōu)化熱處理?xiàng)l件后得到最佳熱處理?xiàng)l件為：90℃，5min。

制備的己酸菌菌液菌種健壯活躍、產(chǎn)氣旺盛，在擴(kuò)大培養(yǎng)時(shí)要注意厭氧培養(yǎng)，無菌接種操作過程。

制備的培養(yǎng)液廣泛應(yīng)用于濃香型白酒的灌窖、窖池保養(yǎng)以及人工窖泥的培養(yǎng)，以期改善和提高濃香型白酒的質(zhì)量。